Etapa II

DEMONSTRAREA UTILITATII PRODUSULUI; ALGORITM INOVATIV DE ACTIUNE

Caracterul inovativ consta in primul rand in realizarea grupului structural hightech compus din principii active cu efecte complementare care se potenteaza furnizand o actiune farmacologica semnificativa in boli degenerative si reumatismale asociate cu inflamatii. Proiectia biocomplexului inovativ cu actiune la nivelul sistemului biologic a fost lansat in algoritmul specific dezvoltarii unui produs. Acesta a fost obtinut prin biotehnologii proprii, aflate in stadiu avansat de optimizare tehnologica, ca urmare a feedback-urilor scanarilor fizico-chimice si a experimentarilor fundamentale si aplicative a profilului citotoxic si activitatii biologice / component bioactiv, toate acestea ducand la definirea de design a grupului structural. Desfasurarea cercetarilor a inclus si transferul tehnologic la nivel pilot pentru obtinerea grupului structural tinta parcurgand etapa importanta a dezvoltarii biotehnologice, prin aplicarea unor tehnologii imbunatatite, cu coerenta si eficienta de rigoare, fiind derulate studii fizico-chimice si microbiologice si de eficienta biologica conform planului de realizarea si obiectivelor propuse.

Realizări tehnologice:

Experiența în cercetări și biotehnologii marine s-a dovedit prin faptul ca tehnologia de obtinere a extractului marin se realizeaza la standarde de calitate si siguranta prezentand garantia reproductibilitatii, prin certificare GMP de catre Agentia Nationala a Medicamentului. Pe aceasta baza, expertiza stiintifica si tehnica concretizata in concepte, strategii, metode si testari in vitro, transfer tehnologic, au facut ca proiectul sa fie viabil prin dezvoltarea unui produs farmaceutic nou.

Eficacitatea terapeutica a extractului standardizat din resurse marine este sinergic potentata prin actiunea puternic antioxidanta la nivel local si sistemic a componentei C1 si de asemenea prin efectul revigorant sistemic si reparator local al componentei C2. Se structureaza astfel un complex inovativ inalt eficient prin mecanisme de actiune directe sau indirecte la nivelul articulatiilor dar si la nivel sistemic, echilibrand balanta homeostatica a organismului prin actiunea antiinflamatoare, antioxidanta; stimularea sintezei fibrelor de colagen, trofic - regenerativa, antihialuronidazica, condrorestitutiva. Intervenind in reglarea acestor procese interrelationate, biocomplexul este destinat terapiei reumatice si degenerative, si a reactiilor inflamatorii: spondiloze, osteoartrite, condrite, osteoporoza, spondilita anchilozanta, dureri articulare, artroze, paradontopatii, traumatisme osteoarticulare, post-interventii chirurgicale, disfunctionalitatilor/ carentelor metabolice premergatoare instalarii patologiei.

Studiile experimentale de dezvoltare a tehnologiei de obtinere si conditionare a grupului structural propus a urmarit obtinerea unui produs inovativ (brevetabil) – sub forma de solutie injectabila pentru preparate injectabile, care sa contina 10 ÷ 20% extract bioactiv de origine marina; 0,5 ÷ 2% o sare a componentei C1 si 2 ÷ 10% o sare a componentei C2.

Biotehnologia de obtinere a complexului bioactiv consta in extractia materialului de origine marina in mediu apos, acidulat cu o solutie de fenol, la temperaturi de 2-80C, timp de 24 ÷ 48h. Extractul primar obtinut, supus filtrarii si concentrarii in evaporatoare sub vid, este purificat prin precipitare cu solvent organic de uz farmaceutic, centrifugare, concentrare sub vid si filtrare cu obtinerea unui extract limpede cu pH 5,5 ÷ 6,5.

Pentru evaluarea calitativa si cantitativa a diferitelor variante experimentale de conditionare a solutiei injectabile cu formula imbogatita cu componente ce cresc valoarea terapeutica a produsului, in cadrul acestei etape a proiectului, au fost testate, dezvoltate si implementate o serie de metode analitice a caror rezultate coroborate permit stabilirea unei formule optime de conditionare a solutiei injectabile tinta. In cadrul studiilor analitice efectuate, metodele fizico-chimice si microbiologice aplicate in vederea stabilirii caracteristicilor variantelor experimentale ale produsului injectabil propun evaluarea aspectelor macroscopice (aspect, culoare), identificarea si dozarea principiilor bioactive tinta si a conservantilor precum si evaluarea sterilitatii produsului prin controlul contaminarii microbiologice. Acesti parametrii calitativi si cantitativi utilizati pentru screening-ul analitic au permis intocmirea specificatiei tehnice a produsului pentru fabricatie.

Exploatarea de resurse marine si utilizarea lor eficienta in asociere cu alte principii active pentru obtinerea de biocomplexe cu sinergisme de actiune sistemica si locala in boli degenerative, reumatismale si inflamatorii a presupus studii avansate de cercetare industriala si dezvoltare experimentala ce ofera baza de date a efectelor moleculare si celulare integrative ale grupului structural inovativ. Prin cercetarile in vitro efectuate la nivel celular si acelular se demonstreaza inalta eficacitate a complexului inovativ in echilibrarea balantei homeostatice a organismului prin actiunea antiinflamatoare si antioxidanta. Componentele grupului structural inovativ s-au dovedit a fi compatibile in proportiile analizate in cadrul modelelor experimentale in vitro, evidentiindu-se atat o stabilitate fizico-chimica a dilutiilor preparate cat si lipsa de citotoxicitate la asocierea dintre componente ceea ce sustine modul corect de raportare intre ingredientele formulei farmaceutice si un nivel limitat de toxicitate. Efectele antioxidante, anti-inflamatorii, de stimulare a sintezei fibrelor de colagen, actiunea trofic-regenerativa, antihialuronidazica si condrorestitutiva evidentiate prin analizele de cercetare industriala reprezinta actiunea cumulativa a componentelor asociate fiind demonstat sinergismul substantelor active in afectiunile degenerative si reumatice.

La nivel de laborator s-au efectuat mai multe variante de formulare de produs injectabil sub forma de solutie care s-au exclus treptat in baza rezultatelor analizelor fizico-chimice/ stabilitate fizico-chimica sau compatibilitate, obtinandu-se o varianta finala a formulei de fabricatie in conformitate cu specificatiile de produs/ Farmacopee Europeana in vigoare care a fost experimentata si la nivel pilot.

MODELE EXPERIMENTALE PENTRU TESTAREA EFICACITATII TERAPEUTICE LA NIVEL CELULAR SI MOLECULAR

1. Screening la nivel molecular privind efectul anti-inflamator si regenerator al tesutului subcondral articular:

Linia celulara de condroblaste, CHON-001, prezinta caracteristici specifice celulelor constitutive ale tesutului subcondral articular.

Model regenerarea matrix-ului articular si subcondral: s-au analizat o serie de gene pentru: colagen tip I (COL1A1) – singurul tip de colagen secretat de celulele CHON-001, si agrecan (ACAN) ce codifica principalele proteine din structura cartilajului care confera integritate si sustinere; metaloproteinaza-1 (MMP-1) ca proteaza a colagenului, in principal, de tip I; metaloproteinaza-3 (MMP-3) – stromelizina-1 care degradeaza fibronectina, laminina, colagenul si proteoglicanii; metaloproteinaza-13 (MMP-13) cu rol particular in degradarea cartilajului datorita hidrolizei predominante a colagenului de tip II; ADAMTS5 (agrecanaza) –- proteina structurala a matricei extracelulare articulare.

Model efectul anti-inflamator: gena codificatoare a interleukinei IL-6 cu rol complex in patogeneza osteoartritei prin initierea raspunsului inflamator; gena pentru interleukina IL-8 – factor chemotactic pentru neutrofile care induce chemotaxia neutrofilelor primare si a altor granulocite determinand migrarea acestora la situsul inflamator; gena pentru interleukina IL-1β implicata in initierea si progresia osteoartritei prin declansarea unei cascade de evenimente intracelulare care determina activarea de proteinaze, crearea de focare articulare pro-distructive, supresia cailor anabolizante si reducerea sintezei matrix-ului extracelular cartilaginos. S-a mimat inflamatia cu stimul pro-inflamator TNF-α , respectiv cu inductor de expresie a genelor pentru proteinele structurale ale matricei subcondrale (TGFβ1 1ng/ml, 24h).

Rezultate Produsul 3 SEH (Combinatia CP C2 C1 (10:4:2)

- nu manifesta efect de regenerare subcondrala articulara pentru ca nu manifesta efect de crestere a expresiei genei pentru colagen tip I crescand si expresia metaloproteinazei MMP-1. Nu influenteaza semnificativ expresia MMP-3 si agrecanazei.

- manifesta efect anti-inflamator prin actiunea de down-reglare asupra genelor codificatoare de interleukine pro-inflamatorii IL-6, IL-8 si IL-1β cu aprox. 50% fata de martorul de solvent.

Rezultate 1

2. Screening la nivel celular privind efectul anti-inflamator al tesutului subcondral articular: CITOKINE PROINFLAMATORII IL-6 SI IL-8 ELIBERATE EXTRACELULAR DE CATRE CONDROBLASTE OSOASE - LINIA CHON-001

Integritatea cartilajului este mentinuta de o balanta a proceselor anabolice si catabolice directionate de citokine. Excesul citokinelor pro-inflamatoare (IL6, IL8) este responsabil de multe manifestari clinice ale degradarilor osteoarticulare. Determinarea citokinelor pro-inflamatorii IL6 si IL8 s-a realizat prin multiplexare si detectie prin citometrie in flux

Rezultate: Produsul 3 SEH induce efect antiinflamator prin inhibitia IL8, principal mediator al chemotaxiei si cronicizarii inflamatiei (cu 30% fata de martor; dexa induce cu 53%)

3. EFICACITATEA TERAPEUTICA PE CARTILAJ ARTICULAR DE IEPURE

Izolare material biologic (condrocite primare)
Cartilajul articular permite miscarea usoara a incheieturii si reprezinta un material capabil sa suporte greutati foarte mari. Proprietatile tesutului sunt datorate compozitiei si structurii matricii extracelulare, care este mentinuta de condrocite. Aceasta matrice hidratata consta in agregate de proteoglicani, ce contin glicozaminoglicani ce sunt amestecati intr-o retea de colagen, predominant de tip II. Condrocitele sintetizeaza diferitele componente ale matricii, enzimele raspunzatoare de catabolismul acesteia (aggrecanaze si matrix metaloproteinaze, sau MMP-uri) precum si inhibitori ai acestor enzime (TIMP). In tesuturile sanatoase, balanta dintre sinteza matricii si degradarea acesteia este bine mentinuta.

Traumele si leziunile degenerative ale cartilagiului articular duc in cele din urma la osteoartrita. In cazul osteoartritei, aceasta balanta este perturbata prin distrugerea progresiva a matricii extracelulare a cartilajului. Degradarea agrecanului de catre agrecanaze conduce la pierderea glicozaminoglicanilor sulfatati si a colagenului de tip II, rezultand in final la distrugerea cartilajului articular si la expunerea directa a osului. In plus, in tesuturile provenite de la pacienti cu osteoartrita se gasesc nivele crescute de MMP-uri. Tratamentele actuale nu sunt foarte eficiente, motiv pentru care sunt necesare noi studii pentru pentru a descoperi metode de tratament mai bune care conduc la regenerarea cartilagiilor articulare. Tratamentele pot tinti inhibarea sau reducerea expresiei proteazelor implicare in degraderea cartilagiului si/sau stimularea condrocitelor pentru a secreta componentele structurale ale cartilagiului. Citokinele inflamatorii, incluzand IL-1β au fost detectate in lichidul sinovial al pacientilor cu osteoartrita, si este deja stabilit ca IL-1β stimuleaza distrugerea cartilajului. In consecinta, un studiu pentru testarea eficacitatii produsului 3SEH pe un model de osteoartrita am ales din preclinic un model ce utilizeaza condrocite primare de iepure stimulate cu IL-1β. Preparatul injectabil a fost introdus in algoritmul de actiune antiinflamatorie pentru determinarea potentialului de reducere a degradarii cartilajului. produsa de citokine. Pentru caracterizarea mecanismului de actiune au fost determinati diferiti parametri: expresia genica a diferitilor actori implicati in procesul inflamator, colagenul total, activitatea enzimatica a MMP-urilor precum si nivelul de nitrati secretati.
S-a analizat in prima faza expresia transcriptilor Cox-2 si Nos2, mediatori importanti ai proceselor imflamatorii. Citokinele proinflamatorii (inclusiv IL-1-β) induc in mod direct expresia Cox2 (enzima inductibila responsabila de producerea prostaglandinelor) si Nos2 (sintetaza de oxid nitric inductibila, exprimata in urma stimularii). Expresia crescuta de Nos2 duce la o crestere a nivelului NO care este un stimul aditional al expresiei Cox2. Rezultatele de RT-PCR cantitativ au aratat un profil asemănător al expresiei pentru transcriptii celor doua gene (Fig. 1).

Rezultate 1 Rezultate 1 Fig 1. Expresia Cox2 si Nos2 in condrocite primare de iepure

In probele nestimulate expresia este scazuta dar creste dramatic in urma stimularii cu IL-1-β. In prezenta 3SEH se observa o inhibitie semnificativa atat a expresiei Cox-2 (scade de 2,1 pentru tratamentul cu 3SEH in raport cu martorul de solvent) cat si a Nos2 (scade de 2,7 pentru tratamentul cu 3SEH fata de martorul de solvent). Aceste rezultate confirma proprietatile anti-inflamatoare ale produsului 3SEH.

Folosind metoda RT-PCR cantitativ s-a testat efectul produsului 3SEH asupra expresiei agrecanului si a colagenului de tip II. Agrecanul, impreuna cu colagenul de tip II sunt principalele componente structurale ale cartilagiului si in particular ale cartilagiului articular. Masa colagenului II reprezinta aproximativ 12%, cea a agrecanului aproximativ 9% iar a apei aproximativ 80% din masa totala a cartilagiului articular.

Rezulatele obtinute au aratat ca atat expresia colagenului II cat si cea a agrecanului sunt inhibate in celulele stimulate cu IL-1-β dar, in timp ce expresia colagenului II nu este influentata semnificativ de tratamentul cu produsul 3SEH (Fig.3), expresia agrecanului creste considerabil in probele tratate cu cele 2 loturi de produs (creste de 2,4 si 1,8 ori pentru tratamentul cu 3SEH proba1, respectiv proba2 fata de martorul de solvent) (Fig. 2).

Rezultate 1 Rezultate 1 Fig 2. Expresia Col2 si Acan in condrocite primare de iepure

A fost de asemenea studiata influenta 3SEH asupra expresiei proteazelor raspunzatoare pentru degradarea proteinelor componente ale cartilagiului articular (Fig. 3). In acest sens a fost testat raspunsul proteazelor Adamts4 (o proteaza responsabila pentru degradarea agrecanului) si Mmp3 (proteaza ce degradeaza fibrionectina, laminina, colagen III, IV, IX si X si proteoglicani din cartilagiu). In cazul Adamts4 s-a observat o crestere a expresiei in celulele stimulate cu IL-1-β si tratate cu solvent, dar expresia scade sub nivelul martorului netratat in probele tratate cu produsul 3SEH. Pentru Mmp3 se observa o puternica stimulare a expresiei ca urmare a tratamentului cu IL-1-β, crestere ce este inhibata semnificativ prin adaugarea 3SEH (scade de 1,8 si 1,5 ori pentru tratamentul cu 3SEH proba1, respectiv 3SEH proba2 fata de martorul de solvent). Impreuna, aceste rezultate demonstreaza ca produsul 3SEH ajuta la pastrarea integritatii cartilagiului atat prin stimularea expresiei agrecanului cat si prin inhibarea expresiei unora dintre enzimele responsabile pentru degradarea proteinelor din cartilagiu.

Rezultate 1 Rezultate 1 Fig 3. Expresia Adamts4 si Mmp3 in condrocite primare de iepure

Pentru a confirma efectul anti-inflamator al produsului 3SEH la nivel de metaboliti celulari s-a determinat cantitatea de NO/nitrit secretat de condrocitele primare in mediul de cultura. NO este un compus foarte instabil care este oxidat spontan in conditii fiziologice, formand nitriti. Cantitatea de nitriti formata poate fi determinata cu ajutorul reactiei Griess. Pentru determinarea cantitatii de nitrit din mediu s-a folosit Griess Reagent System (Promega) conform indicatiilor producatorului. Rezultatele au demonstrat ca tratamentul celulelor stimulate cu produsul 3SEH duce la o scadere importanta a cantitatii de nitrit din mediu (Fig. 4). Cantitatea de nitriti eliberata in mediu de celulele nestimulate este sub limita de detectie a sistemului folosit. Aceste rezultate valideaza rezultatele obtinute pentru Nos2 si confirma inca o data potentialul anti-inflamator al produsului 3SEH.

Rezultate 1 Fig 4.Concentratia de nitriti in mediul de cultura al condrocitelor primare de iepure stimulate

CONCLUZIE: produsul 3SEH suprima efectele inflamatorii ale IL-1-β pe de o parte prin scaderea expresiei transcriptilor genelor proinflamatoare Cox2 si Nos2 si scaderea cantitatii de NO generate iar pe de alta parte prin mentinerea integritatii cartilagiului prin stimularea expresiei de agrecan si prin inhibarea la nivel ARN a productiei de Mmp3 si intr-o mai mica masura a Adamts4.

Determinarea colagenului total:
In urma cuantificarii colagenului total si raportarii la cantitatea de proteina non-colagenoasa, s-a observat ca prezenta IL-1β in mediul de cultura induce o scadere a colagenului total prezent in condrocitele tratate cu martorul de solvent (de la 0.0345 la 0.0280, de la 100% la 81.16%). Aceasta scadere este insa recuperata in urma tratamentului cu 3SEH proba 1 (de la 0.0280 la 0.0363) sau 3SEH proba 2 (de la 0.0280 la 0.0349), -col.negre din grafic. S-a constatat o crestere a colagenului total si in condrocitele nestimulate, dar au fost expuse la 3SEH proba 1 (de la 0.0345 la 0.0409) sau 3SEH proba 2 (de la 0.0345 la 0.0370), Figura 5 – coloanele gri gri.

Rezultate 1 Fig 5.Cuantificarea cantitatii de colagen total raportata la cantitatea de proteina non-colagenoasa.
Numerele reprezinta procentele de colagen total din 3 SEH proba 1 (119% nestimulat, respectiv 129% stimulat) sau 3 SEH proba 2 (107% nestimulat, respectiv 124% stimulat) fata de cantitatea de colagen total din martorul de solvent considerata 100%.

Cresterea cantitatii de colagen care apare in urma tratamentului cu 3SEH proba 1 si 3SEH proba 2 poate aparea prin doua mecanisme: cresterea sintezei de novo de colagen datorata activarii la nivel de RNA, sau reducerea degradarii colagenului existent prin inhibitia colagenazelor. Pentru a verifica cele doua ipoteze, s-au efectuat evaluarile expresiei genice a colagenului de tip II si a metaloproteinazelor raspunzatoare de degradarea acestuia (MMP3) prin qRT-PCR. Rezultatele sugereaza ca produsul 3 SEH actioneaza prin al doilea mecanism mentionat si anume reducerea degradarii prin inhibarea Mmp3, deoarece sinteza de novo de colagen II nu se modifica.

Determinarea activitatii MMP-urilor prin gel zimografie (MMP2 si MMP9)
Proteinele din familia de metaloproteinaze matriceale (MMP-uri) sunt implicate in degradarea matricei extracelulare in procese fiziologice normale (reproducerea sau dezvoltarea embrionara), dar si in procese maligne (artrita sau metastaza). Majoritatea MMP-urilor sunt secretate ca pro-proteine inactive care ulterior sunt activate prin clivare de catre proteinaze extracelulare. MMP9 este o proteaza specifica pentru colagenii de tip IV si V, in timp ce MMP2 are ca substrat colagenul de tip IV, constituentul major al membranelor bazale. Exista mai multe mecanisme prin care se explica inducerea ori reducerea activitatii acestor MMP-uri. Modificarile activitatii enzimatice se pot datora variatiilor la nivel de RNA, la nivelul masinariei de secretie din celula, la nivelul activarii enzimei, precum si la nivelul inhibitorilor acestor enzime.

Rezultate 1 Rezultate 1 Rezultate 1 Rezultate 1
Fig 6.Cuantificarea MMP-uri din geluri de zimografie.

Un studiu recent a aratat in cazul osteoartritei o crestere de MMP2 si MMP9 la nivel de mRNA si proteina (Yang et al, 2013). Acest lucru a fost explicat datorita nivelurilor crescute de IL-1β si TNF-α, care induc producerea acestor enzime. Rezultate similare s-au obtinut si in cazul condrocitelor primare tratate cu IL-1β, unde se observa o crestere pronuntata a activitatii pro-MMP9 si MMP9, in comparatie cu celulele netratate in cazul expunerii la martorul de solvent (de 7.5 ori pro-MMP9 si respectiv 2.3 ori MMP9) (Figura 6). Dupa adaugarea 3SEH proba 1 sau proba 2, activitatea pro-MMP9 prezinta o crestere suplimentara (11.8 ori pentru proba 1 si respectiv 17.9 ori pentru proba 2) in timp ce activitatea lui MMP9 ramane relativ constanta (2.6 ori pentru proba 1 si 1.2 pentru proba 2). Aceasta comportare diferita intre pro-MMP9 fata de MMP9 indica posibilitatea existentei unui mediu inhibitor generat de prezenta lui 3SEH pentru procesarea lui pro-MMP9 in MMP9. Deci mecanismul de actiune in acest caz ar fi inhibitia procesarii pro-MMP9 la MMP9.

MMP2 prezinta un comportament diferit fata de MMP9. In cazul stimularii cu IL-1β, activitatea lui pro-MMP2 este modest crescuta pentru martorul de solvent (de 1.1 ori mai mare fata de celulele nestimulate). In aceleasi conditii, dupa adaugarea 3SEH, activitatea corespunzatoare pro-MMP2 scade, ajungand la aproximativ 0.7 din activitatea martorului stimulat. In cazul lui MMP2, stimularea cu IL-1β induce doar scaderea modesta a activitatii corespunzatoare metaloproteinazei respective (0.85 din martorul de solvent nestimulat). 3SEH induce o scadere pronuntata a MMP2, chiar si in cazul nestimulat, sugerand un alt tip de mecanism: fie inhibitia sintezei de pro-MMP2, tradusa mai departe si prin reducerea lui MMP2, fie blocarea lui pro-MMP2 cu un inhibitor (direct – TIMP1, 2 sau 4 sau indirect printr-un intermediar) care impiedica procesarea acestuia.

In concluzie, aceste mecanisme ce au ca rezultat cresterea cantitatii de colagen, precum si scaderea activitatii MMP2 si MMP9 de catre 3SEH sunt foarte importante pentru aplicatiile clinice ale acestui produs in managementul bolii artritice.

4. Actiunea la nivel celular asupra integritatii structurale, statusului proliferativ, anti-inflamator, antioxidant la nivelul tesutului articular de iepure - CULTURA PRIMARA DIN CARTILAJ DE IEPURE

EXPRESIA INTEGRINELOR MEMBRANARE

Condrocitele exprima anumite integrine ce pot fi receptori pentru fibronectina(α5β1), colagen de tip II si VI (α1β1, α2β1, α10β1), laminina (α6β1) si vitronectina si osteopontina (αVβ3). Prin asigurarea unei legaturi intre matrixul extracelular si citoschelet, integrinele sunt importanti transduceri ai stimulilor mecanici. Evaluarea supraexpresiei integrinelor s-a bazat pe marcare cu anticorpi fluorescenti, specifici lanturilor glicoproteice tinta (α1, α2, α5 si β1) si analiza prin citometrie in flux. Specificitatea marcarii s-a verificat prin realizarea in paralel a unor probe de control izotipic.

Rezultate:S-a detectat la nivel membranar in celulele de cartilaj o integrina: lantul glicoproteic α5, responsabil de adeziunea condrocite-cartilaj, de legarea fibronectinei si de activarea sintezei de pro-colagen. Produsul 3 SEH actioneaza in sensul cresterii supraexpresiei acestui lant cu 20% fata de martor, indicand un rol structural, de sustinere prin realizarea unor legaturi suplimentare celula – martix extracelular. care reprezinta proteine membranare implicate in adeziunea celula- matrice extracelulara in cultura primara din cartilaj de iepure=> rol structural prin realizarea unor interactiuni mecanice de adeziune condrocit – cartilaj prin legarea fibronectinei din matrix de integrina celulei. Expresia acestei integrinei sta si la baza unor cascade extracelulare care duc la activarea sintezei de procolagen in condrocite
In cadrul experimentelor pe linia celulara de condrocite osoase, CHON-001, s-a demonstrat activarea expresiei lantului α2 de catre produs, favorizand prin aceasta legaturile colagen de tip II sau VI – condrocit, cu rol in mentinerea integritatii structurale a cartilajului.

EVIDENTIEREA SECVENTIALITATII CICLULUI CELULAR

Turn-overul celular in cartilajul articular este incetinit fata de alte tipuri de celule, ceea ce sta la baza capacitatii scazute de raspuns la degradare si reparare a leziunilor. In acest context, este importanta stimularea proliferarii celulare a condrocitelor in degradarile cartilajului articular.

Rezultate:Produsul 3 SEH stimuleaza usor faza de sinteza ADN in cadrul procesului de diviziune si proliferarea celulara cu 13% fata de martor accelerand turn-overul celular. Actiunea demonstrata sustine rezultatele testelor anterioare realizate pe linia celulara de condrocite osoase, CHON-001, care au demonstrat un efect de accelerare a statusul proliferativ celular.

STRESS OXIDATIV CELULAR

Evaluarea stressului oxidativ intracelular s-a realizat prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid– marcare cu DCFH-DA, respectiv HE) si analiza de citometrie in flux.

Rezultate:Produsul 3 SEH prezinta efect antioxidant prin scaderea radicalilor liberi produsi intracelular si anume, cantitatea de apa oxigenata (58%) si a anionului superoxid (17%) - comparativ cu martorul pozitiv (omega 10μM), prin mecanisme directe asupra radicalului liber, fie prin activarea enzimelor implicate in transformarea acestei specii de oxigen reactive.

Determinare ACTIVITATE ANTIHIALURONIDAZICA prin metoda turbidimetrica (FC1-MAPF-063) si colorimetrica:

Rezultate:Produsul 3 SEH prezinta efect antioxidant prin scaderea radicalilor liberi produsi intracelular si anume, cantitatea de apa oxigenata (58%) si a anionului superoxid (17%) - comparativ cu martorul pozitiv (omega 10μM), prin mecanisme directe asupra radicalului liber, fie prin activarea enzimelor implicate in transformarea acestei specii de oxigen reactive.

Rezultate 1

Prepararea la nivel pilot a produsului 3SEH a constat in derularea mai multor etape pana la obtinerea produsului finit conform Ghidului de Buna Practica de Fabricatie pentru produse farmaceutice si prevederilor Farmacopeei Europene in vigoare: achizitionarea de materii prime (sarurile componentelor C1 si C2) de la producatori autorizati pentru fabricatia de materii prime de uz farmaceutic; analiza fizico-chimica si microbiologica a materiilor prime; analiza fizico-chimica si microbiologica a recipientelor/ spatiilor de preparare; cantarirea in conditii controlate microbiologic a materiilor prime; derularea etapelor procesului de fabricatie in incinta clasificata de curatenie (flux de fabricatie certificat GMP); control interfazic al produsului; filtrarea sterilizanta a produsului; conditionare in fiole brune 1ml; control de produs finit conform specificatiei.

FABRICATIA:
Formula farmaceutica a seriei de fabricatie: solutie injectabila pentru preparate injectabile cu continut de 10÷20% extract bioactiv de origine marina, 0,5÷2% componenta C1 sau o sare a acesteia, 2÷10% componenta C2 sau o sare a acesteia si un agent de chelare a ionilor metalici 0,01÷0,1% ca excipient stabilizator al solutiei.
Procesul de fabricatie al componentei active CP (concentrat bioactiv din peste marin maruntit-CBPMM) se deruleaza in conditii certificate GMP (Good Manufacturing Practice) conform urmatoarelor etape: maruntirea materiei prime; cantarirea si masurarea materiei prime; extractia componentelor active; filtrarea, concentrarea si purificarea concentratului; control interfazic al produsului; ambalare; control produs finit; carantina; depozitare.

Schema procesului de fabricatie a produsului farmaceutic 3SEH:

Rezultate 1

Puncte de control:
P.C.I – analiza fizico-chimica si microbiologica pentru recipiente de preparare; P.C.II – analiza fizico-chimica si microbiologica a materiilor prime conform prevederilor din specificatie; P.C. III - analiza fizico-chimica si microbiologica a produsului 3SEH inainte de filtrare si P.C. IV - analiza fizico-chimica si microbiologica a produsului 3SEH dupa filtrare; P.C. V - analiza fizico-chimica si microbiologica a produsului 3SEH conform specificatie produs; P.C. VI - analiza fizico-chimica si microbiologica a produsului 3SEH dupa ambalare secundara conform specificatiei de produs finit.

Analizele de control al calitatii efectuate pe solutia injectabila 3SEH au evidentiat incadrarea produsului in conditiile de calitate propuse in proiectul de specificatie de produs – studii de stabilitate. Au fost demarate studii de stabilitate a solutiei injectabile la temperaturi de 250C si 400C. In conditii de pastrare pe termen lung (25ºC2ºC /max. 60%5%UR), probele de produs 3SEH corespund la parametrii analizati pana in prezent, evidentiindu-se faptul ca, atat din punct de vedere al parametrilor calitativi (aspect, culoare, identificare compusi) cat si din punct de vedere al parametrilor cantitativi (dozari cantitative), produsul este stabil pana la momentul T12luni la 25ºC2ºC, aceasta reprezentand temperatura de pastrare a produsului finit.

Dezvoltarea farmaceutica si fizico-chimica a produsului 3SEH se concretizeaza intr-o formula de fabricatie cu componente compatibile si stabile fizico-chimic si microbiologic pe termen lung, precum si un proces de fabricatie reproductibil.

Efectul dovedit al produsului 3SEH in algoritmul de restabilire a homeostaziei in boli inflamatorii, degenerative si reumatice sustine certificarea sa ca produs farmaceutic de catre ANM in vederea aprobarii efectuarii studiilor clinice conform normelor europene de autorizare a farmaceuticelor.

Strategii de marketing în vederea promovării produsului


Conceperea preţului de fabrică va permite distribuitorilor să aibă marje mari pe care le va împărţi cu beneficiarii produsului (discounturi, campanii de fidelizare pentru medici şi pacienţi, promovare directă). Se considera conceperea si pozitionarea produsului ca prim derivat din produsul de baza, superior acestuia ca patologii tinta. Fixarea pretului, pentru asimilare si neafectarea vanzarilor produsului de baza Verificarea, la momentul lansarii, ca produsul se gaseste in toate farmaciile cu care distribuitorii nostri au contracte si monitorizarea farmaciilor dupa acest moment 4.Promovarea va fi conform legii pentru un injectabil: organizarea lansarii in fiecare tara unde se va autoriza, publicarea de articole stiintifice vizand efectele terapeutice, organizarea unui site interactive cu pacientii pentru intrebari, comentarii dupa tratament, sfaturi in cazuri special.

Piaţa ţintă (dimensiunea pieţei, segmentul de piaţă ţintă şi trendul acesteia, competiţia, clienţi existenţi sau potenţiali)


Conceptul de piaţă are în vedere atingerea unui volum de vânzări care treptat să depăşească pragul de rentabilitate in conditiile actuale interne si internationale care să asigure realizarea planului de comercializare. Produsul va acoperi o gamă largă de afecţiuni cu efect local <->efect sistemic bine interrelationat contribuind la reducerea costului tratamentelor pe ansamblu. Produsul va fi comercializat pe o piaţă cu o creştere a incidenţei afecţiunilor tratate cu 15%, pe o piaţă emergentă cu o creştere stabilă pe termen lung.

Metode de vânzare şi distribuţie preconizate


Ca perspectiva pentru urmatorii ani, distributia noului medicament se va face conform Legii Medicamentului, prin distribuitori autorizati de ANM.